蛋白提取實驗步驟

蛋白提取實驗步驟：

1、細胞總蛋白提取

A、對于懸浮細胞: 離心收集細胞，每106細胞加250 ul RIPA（在使用前數分鐘內加入蛋白酶抑制劑），振蕩。如果需要提高蛋白濃度，可以適當減少細胞總蛋白提取試劑體積。

B、對于貼壁細胞:

a、用TBS沖洗細胞2-3次。最后一次http://www.ipr-jzsc.com徹底吸干殘留液。

b、加入適當體積的 RIPA（使用前數分內加入蛋白酶抑制劑）于培養板、瓶內3-5分鐘。期間反復晃動培養板、瓶，使試劑與細胞充分接觸。

c、用細胞刮刀將細胞及試劑刮下，收集到1.5ml離心管中。

C、冰浴30min，期間用移液器反復吹打，確保細胞完全裂解。

D、12000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。

2、組織蛋白提取：

A、組織塊用冷TBS洗滌2-3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器。加入10倍組織體積本試劑（使用前數分鐘內加入蛋白酶抑制劑）冰上徹底勻漿。如果需要提高蛋白濃度，可以適量減少該試劑體積。

B、將勻漿液轉移至1.5ml離心管中，振蕩。冰浴30min，期間用移液器反復吹打，確保細胞完全裂解。

C、12000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。

注意事項

1、組織盡可能新鮮，若不能及時提蛋白，組織標本應保存在-80℃冰箱，并避免反復凍融。

2、全程必須在冰上進行，避免蛋白降解。

3、蛋白酶抑制劑在水溶液中不穩定，需在RIPA使用前數分鐘加入蛋白酶抑制劑。

4、裂解過程中如有溶液粘稠現象可用移液器（200μl）反復吹打，或再加入適量裂解液以保證充分裂解。

5、總蛋白溶液不穩定（蛋白酶依舊有活性）可在-80℃短時間保存，建議立即加入蛋白上樣緩沖液變性后與-20℃保存，避免反復凍融。

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