mRNA差異顯示方法研究進展

健康網訊:

黨耕町　100083 北京醫科大學第三醫院骨科

宋國立　美國加州大學圣地亞哥分校骨科與生物工程系

　　 哺乳動物細胞約有100?000個不同的基因，在一定時間、空間中僅有10％～15％的基因表達，這種表達受到嚴格調控［1］。運用mRNA 差異顯示（differential display,DD）方法［2］，可將不同細胞類型或同一細胞在不同環境下表達的基因進行比較，從分子生物學水平上提供信息，這對理解細胞的生命過程極有幫助。該技術一經問世，立即得到廣泛應用，但同時也遇到許多問題，所以Debouck［3］曾對該方法提出質疑。現將DD的研究進展簡要綜述如下。

　　一、DD方法基本原理

　　DD的基本原理是將具有可比性的細胞在某一條件下可表達的mRNA 群體通過逆轉錄方法變成相應的cDNA 群體，以此為模板，利用一對特殊引物，即3?anchor 引物和5?arbitrary引物，在一定條件下進行PCR擴增，得到與mRNA相對應的“標簽”（tags），然后用變性聚丙烯酰胺測序膠分析其差別，將有差別的基因克隆化，進一步分析其結構與功能。DD依賴三種技術：（1）mRNA逆轉錄技術；（2）以特定引物進行的PCR技術；（3）DNA測序膠電泳技術。

　　二、DD方法的優點及其應用

　　用某一方法來尋找mRNA表達的差異，至少要滿足下列要求：（1）在一定時間、空間里，每一個細胞約有15 000種mRNA表達，其中除少數屬高豐度表達外，大量的屬于低豐度表達，即要求使用的方法足以顯示低豐度mRNA；（2）重復性要好；（3）實驗過程中能夠步步驗證比較（side-by-side comparison）；（4）得到的產物能代表相應的mRNAs或cDNAs，并能由此找到相應的cDNA 序列；（5）省時，簡便易行。

　　 既往對mRNA的比較研究中多用減數雜交方法［4］（subtraction hybridization），該方法靈敏，可顯示低豐度RNA，但是步驟復雜，需時較長，而且在得到最終結果前無法步步驗證對照比較，故不易重復，并且需要大量的RNA作起始研究材料。這一點對RNA來源不易者（如手術活檢標本）極不利［5，6］。

　　DD的優點在于：（1）僅需0.2 μg總RNA作為起始材料；（2）可同時分析多組樣品；（3）敏感性高，可檢出低豐度mRNA；（4）實驗周期短，約8天即可完成［7］，便于重復；（5）最突出的優點是實驗過程中可步步驗證比較。可簡單地將DD的特點概括為“3SRV”，即“Simplicity，Sensitivity，Speed，Reproducibility，Versatility”。

　　DD方法因有上述優點，被廣泛應用。例如：Musholt等［8］應用DD方法對手術切下的髓樣甲狀腺癌標本與局部轉移的淋巴結進行了比較，發現了兩個新的表達基因MDF-1和MDF-2，并認為這兩個基因在髓樣甲狀腺癌的進展與轉移中起了重要作用；Zuo等［9］研究潰瘍

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