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TCB4-1細胞培養技術+-2-
第四章
細胞培養技術
1
Outline
1.
2.
3.
4.Animal cell cultureHuman cell cultureStem cell cultureTumor cell culture
2
Deng XB, et al., Apoptosis. 201143
Animal cell culture
?Primary culture
Sensitive
Complex
?Cell line
ATCC (American Type Culture Collection)
4
動物原代細胞培養技術
?動物細胞與組織培養
是從動物體內取出細
胞或者組織，模擬體
內的生理環境，在無
菌、適溫和豐富的營
養條件下，使離體細
胞或者組織生存、生
長并維持結構和功能
的一門技術。
5
6
每代貼附生長細胞的生長過程?游離期
?貼壁期
?潛伏期
?對數生長期
?停止期（平臺期）
7
8
游離期：
細胞接種后在培養液中呈懸浮狀態，也稱懸浮期。此時細胞質回縮，胞體呈圓球形。
9
10
貼壁期：
?細胞附著于底物上，游離期結束。細胞株平均在10 min－4 h貼壁。
底物：膠原、玻璃、塑料、其他細胞等。?血清中有促使細胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的附著。?進口塑料培養瓶涂有生長基質（化學合成的
11功能基團）。
12
潛伏期：
此時細胞有生長話動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期一般為6～24小時。對數生長期：
細胞數隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。
停止期（平臺期）：
細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂。機制：接觸抑制、密度依賴性。13
倒置顯微鏡
?一般觀察：
?培養液顏色（CO2、pH指示劑）桃紅色－正常；橙黃色－較好；
淡黃色－時間過長、營養不足、細胞死亡紫紅色－死亡
?細胞透明度
顆粒物、空泡、胞膜
14
15
圖受精卵的全能性
16
圖植物細胞的全能性
17
What is the stem cell？
細胞在分化過程中往往由于高度分化而完全失去了再分裂的能力，最終衰老死亡。機體在發展適應過程中為了彌補這一不足，保留了一部分未分化的原始細胞，稱之為干細胞。一旦需要，這些干細胞可按照發育途徑通過分裂而產生分化細胞。
18
?Tree of Embryon
Development
Mesoderm: 中胚層Endoderm: 內胚層Ectoderm: 外胚層Implantation: 植入Uterus: 子宮19
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Totipotent cells: 全能細胞
Pluripotent stem cells:
多能干細胞
圖干細胞的分化潛能
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分類
?按分化能力的大小，干細胞可以分為：
?全能干細胞，它具有形成完整個體的分化潛能。胚胎干細胞就屬于此類，它具有與早期胚胎細胞相似的形態特征和很強的分化能力，可以無限增殖并分化成為全身200多種細胞類型，從而可以進一步形成人體的任何組織或器官。
22
?專門型干細胞，只能向一種類型或密切相關的兩種類型的細胞分化。利用專門型干細胞培育人體細胞和組織的研究已經取得了一定成果，但利用前景更廣闊的，還是分化能力最強的全能干細胞。如果能源源不斷地獲得這種全能干細胞，就可以在體外誘導產生不同的組織細胞甚至器官供移植。
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胚胎干細胞生物學特征：
?具有早期胚胎細胞相似的形態特征，核型正常，保留了正常二倍體的性質；?具有無限增殖的能力；
?具有發育的多潛能性；
?具有種系傳遞功能；
?具有培養細胞所有的特征，可在體外培養、克隆、凍存及進行遺傳操作。
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材料
?PMSG（孕馬血清）、HCG（絨毛膜促性腺激素）、DMEM 培養液
?2+無CaPBS 緩沖液；磷酸鹽緩沖液（PBS 液）；0.125 %胰酶EDTA 混合液；絲裂酶素C2+、Mg
?胎牛血清、新生牛血清
?白血病抑制因子；干細胞生長因子；牛胰島素
25
方法
1.
2.
3.
4.
5.胚胎的獲得與培養內細胞團的分離干細胞集落的分離干細胞的鑒定統計分析
26
1. 胚胎的獲得與培養
?胚胎分別來自體成熟的自然發情或超數排卵的雌性昆明白小鼠，129 品系小鼠（6 周齡）。檢到陰道栓的早晨，記為015 dpc。分別于315 和4 dpc ，斷頸處死孕鼠，取出子宮，用含5%NBS的PBS 液從子宮角沖胚胎。
27
?在解剖鏡下，把沖洗后的胚胎轉移到鋪有飼養層的培養板中，分別采用3 種不同培養液，即培養液1 : DMEM 液+ 10% NBS + 10% FCS培養液2 : 培養液1 + 1000 IU/ml IF
培養液3 : 培養液1 + 10 mg/ml 胰島素
37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每天觀察1 次，加、換液1 次，記錄有關胚胎貼壁、內細胞團（inner cell mass, ICM）出現等生長情況。
28
2. 內細胞團的分離
?胚胎接種到有飼養層的培養板中培養4～5 d 后，內細胞群（ICM ）長大，出現卵圓柱狀或島狀形態，周圍滋胚層細胞明顯展開，此時應分離ICM。
29全能細胞
30
?2+棄去原培養液，加入無Ca2+、Mg的PBS 液洗1 次。在解剖鏡下剝去ICM 周圍的滋胚層細胞，用吸管把ICM 轉移到干凈的培養皿中。加一滴胰酶于ICM 上，37℃，消化3 min。
?將ICM 轉移到新的培養液中，用吸管吹打將其打散。把打散的細胞接種到有新鮮飼養層的培養板中，在37℃、5% CO2培養箱中繼續培養。
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3. 干細胞集落的分離
?分散的ICM 細胞培養3～7 d 后，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。
?此時形成的干細胞集落為F1 代，在解剖鏡下將F1 代干細胞集落挑出，按照ICM 分離法離F1代干細胞集落，再獲得的干細胞集落稱為F2 代，將F2 代干細胞集落挑出，再進行分離傳代數次，直至獲得純凈的ES 細胞集落。
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4. 干細胞的鑒定
?形態
?AKP （堿性磷酸酶）染色
33
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(1) 形態鑒定：
典型的干細胞
?體積較小，有一個大核和少量的細胞質。核中有一個或二個明顯的核仁黑色結構。?細胞緊密成群，細胞界限不易區分。?在集落的邊緣區域可以看到清晰的單個細胞。
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(2) AKP 染色鑒定：
?將待測細胞用含7.5%蔗糖的1%多聚甲醛固定，?底物buffer（100 M Tris-HCl pH9.5，50 mmol/l NaCl MgCl2，0.11% Tween-20）平衡，室溫避光染色：75 mg/ml nitroblue tetrazolium (NBT，硝基藍四氮唑) 溶于70% dimethyl-formamide (DMF) ，50 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-in-dolyphophate toluidinium salt (BCIP) 溶于100%DMF ，染色前分別取45 μl 、35 μl 溶于10 ml 底物buffer 中，新鮮配制。ES ( PGC、EG) AKP 染色被染為深藍紫色，飼養層細胞、分化細
36胞不著色。
5. 統計分析
?SPSS
?Origin
37
誘導多能干細胞（
Induced pluripotent stem cells, iPS cells
）
2007年11月20日，《細胞》和《科學》雜志幾乎同時發表了來自日本京都大學的山中伸彌（ShinyaYamanaka）團隊和美國威斯康星大學的詹姆斯·湯姆森（JamesThomson）/俞君英團隊，通過插入四個特定基因，第一次成功地將普普通通的人體38皮膚細胞，直接改造為功能與胚胎干細胞類似的誘導多能干細胞（iPS）
iPS干細胞建立的過程主要包括：
1.分離和培養宿主細胞
2.通過病毒介導或者其他的方式將若干多個多能性相關的基因導入宿主細胞
3.將導入相關基因的細胞種植于飼養層細胞上，并于胚胎干細胞（Embryonic Stem cell，ES 細胞）專用培養體系中培養，同時在培養中根據需要加入相應的小分子物質以促進重編程
4.出現ES樣克隆后進行iPS干細胞的鑒定（細胞形態、表觀遺傳學、體外分化潛能等方面）
39
iPS干細胞的應用
?在基礎研究方面
它的出現，已經讓人們對多能性的調控機制有了突破性的新認識細胞重編程是一個復雜的過程，除了受細胞內因子調控外，還受到細胞外信號通路的調控。對于Oct4、Sox2和Nanog等維持于細胞自我新能力的轉錄因子的研究正在逐漸地展開；利用iPS干細胞作為實驗模型，只操縱幾個因子的表達，這更會大大加速對多能性調控機理的深入研究。
?在實際應用方面
iPS干細胞的獲得方法相對簡單和穩定，不需要使用卵細胞或者胚胎。這在技術上和倫理上都比其他方法更有優勢，iPS干細胞的建立進一步拉近了干細胞和臨床疾病治療的距離，iPS干細胞在細胞替代性治療以及發病機理的研究、新藥篩選方面具有巨大的潛在價值。此外，iPS干細胞在神經系統疾病、心血管疾病等方面的作用也日益呈現，iPS干細胞在體外已成功地被分化為神經元細胞、神經膠質細胞、心血管細胞和原始生殖細胞等。在臨床40疾病治療中具有巨大應用價值。
Kyoto team generates kidney tissue from iPS cells間介中胚層（intermediate
mesoderm，IM）是位于軸旁中胚層
和側中胚層之間的中胚層組織，可
分化為腎臟的主要器官，Osr1是IM
特異性的標志蛋白。該研究首先通
過同源重組的方式，構建Osr1-GFP
human induced pluripotent stem
cells (hiPSCs) 報告細胞。利用四
種方法誘導iPS細胞分化成IM細胞，
并通過Osr1-GFP進行追蹤。從大鼠
胚胎內取出的腎臟細胞與IM混合培
養，最終成長為具有管狀結構的組
織。該研究顯示，利用iPS細胞可以
誘導分化成立體的腎臟器官
1. Generation of OSR1-GFP knock-in hiPSC lines
?首先將含有OSR1的BAC載
體轉入E. coli 中
?之后將OSR1部分編碼區替
換成EGFP和PGK-Neo
cassettes，再用Cre重組酶
將PGK-Neo去除，完成基
因的敲入
?用選擇性培養基篩選已選
中的細胞。最后獲得OSR1-
GFP敲入的hiPSC細胞
42
2. Establishment of robust induction methods
of IM cells
43
?EB（embryoid body）method
a)
b)
c)當hiPSC細胞濃度達到80%時（10-cm的培養皿），用PBS沖洗細胞，在DMEM中加入1 mg/ml膠原酶IV，培養細胞10min 。用PBS沖洗細胞，換成stage1培養基對細胞進行培養（DMEM/ F12 +Glutamax ，500 U/ml雙抗，2%FBS)將細胞接種到六孔板中，培養基為stage1，并添加100ng/ml 激活素A 和100ng/ml Wnt3a或1–3 mM CHIR99021。培養三天后將細胞轉移至明膠培養皿上，培養20天。采用stage 2培養基（DMEM/F12 +Glutamax，0.1 mM 非必需氨基酸，500 U/ ml雙抗，0.55 mM 疏基乙醇，10% KSR，100 ng /ml，BMP7 (R&D Systems) ，100 ng Wnt3a 或1–3 mM CHIR99021）。
?Colony method
a)
b)將生長在mouse embryonic ?broblasts (MEF) 培養層上hiPSC細胞分離出來（CKT溶液），在明膠培養皿中培養30min，去除MEFs，之后將細胞接種于人工基底膜培養皿中于ES培養基中進行培養。當細胞密度達到70%，按照EB method 的方法完成stage1，stage2的操作。
?Single-cell method
a)
b)hiPSC同樣生長在MEF上，按照上述方法去除MEFs，用Accutase消化細胞使hiPSC形成單個細胞將細胞種于Collagen Type I-coated 培養皿中，按照按照EB method 的方法完成stage1，stage2的操作，其中在stage1培養過程中額外加入10 mM Y27,632
?Serum-free-cell method
采用無血清培養基DMEM/ F12 +Glutamax ，500 U/ml雙抗，1×B27，其他步驟同Single-cell method
44
3. Characterization of developmental potential of
human IM cell
?hiPSC分化的
于24孔板中，用stage2的培養基并添加10 mM Y27,632 和10 ng/ml TGFβ1培養7天。
?從ICE小鼠的第11.5天的胚胎中取出后腎組織，之后用0.05%胰酶-EDTA 37℃作用10 min，用腎培養基進行培養10min ，然后過濾。
?10×104后腎細胞與之前處理的1×104 OSR1(GFP)+細胞混合接種于96孔板中。加入10 mM Y27,632，37℃過夜培養，形成聚合體。器官培養一周后，聚合體逐漸穩固。
45+OSR1(GFP)細胞培養11天后，接種
利用病人尿液細胞獲得神經干細胞通過轉染攜帶表達干細胞因子基因的載體的方式將一些干細胞因子導入從病人尿液中分離而來的細胞中并通過特殊的誘導培養基培養，成功地將病人的尿液細胞誘導轉變為具有功能的神經干細胞。這些由尿液細胞轉變而來的神經干細胞能夠在體外擴增并在適當的條件下分化成熟為人體中各種存在的神經元和角質細胞。在進一步的動物模型的移植實驗中，能夠很好的在46
Nature Methods 10: 84–89 (2013)
1. Isolation and culture ofHuman urine cells(HUCs)取中段尿500ml離心，獲得細胞，用尿液細胞培養基（1:1 DMEM/F12 培養基，10% FBS，0.1 mM 非必需氨基酸, 1 mM GlutaMAX，0.1 mM β-疏基乙醇）進行培養。
2. Generation of integration-free
nPcs from human urine cells
a)包含OCT4，SOX2，KLF4 和SV40LT基因的
oriP/EBNA1-based pCEP4 載體與含有miR302–
367 precursor的pCEP4 載體共轉染到HUCs。
b)將共轉染后的HUCs接種到人工基底膜包被的6孔
板中，用尿液細胞培養基進行培養。
c)第二天換成mTeSR 或5i培養，每兩天換一次液，
15天之后，從5i中挑選克隆并于新的人工基底膜包
被的培養皿中進行培養。
d)將細胞分離成單個細胞并用神經細胞的培養液進
行培養。
47
3. Neural differentiation in vitroa)pan-neuronal分化
hUiNPCs 單細胞接種到人工基底膜包被的培養皿中，用神經細胞培養液N2B27并且加入EGF 和bFGF，神經營養因子BDNF，GDNF，CNTF，IGF1（10 ng/m)，1 ?M cAMP，細胞分化兩周后，通過檢測不同神經細胞的不同標記蛋白來檢測分化情況b) 樹突細胞的分化
hUiNPCs 種于poly-l-ornithine/laminin基底上，用DMEM/F12 培養基并添加1% N1，biotin (100 ng/ml)，PDGF-AA (20 ng/ml)，NT3 (20 ng/ml), 1 ?M cAMP and bFGF (10 ng/ml) 培養一周。之后三周的培養用IGF1替換bFGF 48
Tumor cell
49
腫瘤細胞的培養
50
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