PCR產(chǎn)物靶向克隆法構(gòu)建pET15b-CAT及His-tag-CAT融合蛋白的表達與純化

目的:將人過氧化氫酶(Catalase,CAT) cDNA 的PCR擴增產(chǎn)物定向克隆到pET15b載體上以構(gòu)建重組質(zhì)粒pET15b-CAT,并表達和純化出His-tag-CAT融合蛋白. 方法:擴增目的基因的PCR引物的5′端加上與線性化載體同源的堿基序列,以使PCR的擴增產(chǎn)物兩端分別帶上15個和線性化載體兩端同源的堿基序列.以pZeoSV2(+)-CAT為模板進行靶向克隆所需的人CAT cDNA擴增. 將純化的人CAT cDNA PCR產(chǎn)物與經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ酶切的線性化載體pET15b以6∶1摩爾數(shù)之比混合于含重組酶的反應(yīng)液中,25 ℃反應(yīng)30 min,將PCR產(chǎn)物定向克隆于目標(biāo)載體pET15b上,獲得重組質(zhì)粒pET15b-CAT.重組質(zhì)粒經(jīng)PCR,XhoⅠ酶切和DNA測序鑒定.pET15b-CAT轉(zhuǎn)化BL21(DE3)宿主菌,用IPTG誘導(dǎo)表達出His-tag-CAT融合蛋白,采用Ni2+-NTA樹脂進行親和層析. 結(jié)果:人CAT cDNA的PCR擴增產(chǎn)物與經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ酶切的線性化載體pET15b發(fā)生了同源重組反應(yīng),經(jīng)鑒定采用PCR產(chǎn)物靶向克隆法成功構(gòu)建了pET15b-CAT.SDS-PAGE和Western blot結(jié)果表明,轉(zhuǎn)化了pET15b-CAT的宿主菌表達出了His-tag-CAT融和蛋白,經(jīng)Ni2+-NTA樹脂親和層析得到了純化的His-tag-CAT,并在體外檢測到其具有特異的過氧化氫酶的活性,活性值為80.23 U/g.結(jié)論:采用PCR產(chǎn)物靶向克隆法成功地構(gòu)建了pET15b-CAT,并表達和純化出了His-tag-CAT融和蛋白,為采用外源性CAT防治與氧化應(yīng)激損傷相關(guān)性疾病奠定了基礎(chǔ).

作 者： 王家寧 郭凌鄖 譚艷 鄭飛 孔霞 黃永章 WANG Jia-ning GUO Ling-yun TAN Yan ZHENG Fei KONG Xia HUANG Yong-zhang   作者單位： 鄖陽醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所,湖北,十堰,442000  刊 名： 鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報  ISTIC 英文刊名： JOURNAL OF YUNYANG MEDICAL COLLEGE  年，卷(期)： 2008 27(3)  分類號： Q781 Q786  關(guān)鍵詞： 過氧化氫酶   聚合酶鏈反應(yīng)   靶向克隆   原核表達   組氨酸標(biāo)簽  

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