融合酶表達載體的構建及出現問題的初探

目的:將限制性內切酶Fok Ⅰ催化區域基因(631bp)和PI-Sce Ⅰ識別區域的基凼(546bp)連接到一起,克隆入載體質粒pET28a-~+中,為表達新的限制性內切酶融合酶做準備.方法:分別以啤酒酵母和海床黃桿菌作模板,PCR擴增PI-Sce Ⅰ和FokⅠ基因片段,再將它們克隆人載體質粒pET28a~+,然后對整合質粒進行雙酶切檢測.結果:整合過程中,無論是PI-Sce Ⅰ還是Fok Ⅰ基因片段,都能單獨成功插入載體,但當插入第二段基因片段時,酶切結果顯示大約600bp的基因片段缺失了.結論:缺失可能因為兩段連在一起的新基因在轉化過程中對宿主細胞有毒性,宿主細胞對其進行了剪切;也可能這兩段基因會形成某種高級結構而導致其不能很好的連接,產生缺失現象.

作 者： 崔寶寧 王芳 王艷萍 張治洲   作者單位： 泰達BIO-X系統生物技術研究中心,天津科技大學,天津300457  刊 名： 生物技術  PKU 英文刊名： BIOTECHNOLOGY  年，卷(期)： 2010 20(2)  分類號： Q819  關鍵詞： 限制性內切酶   PI-Sce Fok Ⅰ   pET28a~+   克隆   雙酶切   restriction endonuclease   PI - Sce Ⅰ   Fok Ⅰ   pET28a~+   clone   double digest  

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